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Elisa試劑盒PCR反應的五要素都是哪些?
點擊次數(shù):606 更新時間:2021-12-27
  Elisa試劑盒參加PCR反應的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
 
  引物:引物是PCR特異性反應的關鍵,PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上,只要知道任何一段模板DNA序列, 就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物,利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。設計引物應遵循以下原則:
 
  ①引物長度: 5-30bp,常用為20bp左右。
 
  ②引物擴增跨度: 以200-500bp為宜,特定條件下可擴增長至0kb的片段。
 
  ③引物堿基:G+C含量以40-60%為宜,G+C太少擴增效果不佳,G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC隨機分布,避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
 
  ④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu),避免兩條引物間互補,特別是3'端的互補,否則會形成引物二聚體,產(chǎn)生非特異的擴增條帶。
 
  ⑤引物3'端的堿基,特別是末及倒數(shù)二個堿基,應嚴格要求配對,以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。
 
  ⑥引物中有或能加上合適的酶切位點, 被擴增的靶序列有適宜的酶切位點, 這對酶切分析或分子克隆很有好處。
 
  ⑦引物的特異性:引物應與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。
 
  引物量:每條引物的濃度0.~umol或0~00pmol,以低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好,引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增,且可增加引物之間形成二聚體的機會。

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